В биомедицинските лаборатории има клас оборудване, което изглежда сдържано, но е почти стандартно в отделенията по патология, невронаучните лаборатории и центровете за разработване на лекарства – криостатният микротом. За разлика от обикновените криостати, използвани за изследване на физически материали, криостатният микротом е специално проектиран да нарязва биологични тъкани на срезове с микрона дебелина при ниски температури за микроскопско наблюдение и анализ. През последните години, водени от прецизната медицина и транслационните изследвания, полетата на приложение на криостатния микротом се разширяват с безпрецедентна скорост.
Какво представлява криостатният микротом?
Просто казано, това е инструмент, който съчетава камера за замразяване с устройство за прецизно разделяне. Тъканните проби бързо се замразяват и втвърдяват в камера с постоянна температура при –20°C до –40°C, след което се нарязват на секции с дебелина от 1–100 микрона с помощта на високопрецизно острие, елиминирайки необходимостта от досадни стъпки като вграждане с парафин и дехидратация. Тази характеристика "замразяване и изрязване на място" го прави незаменим в ситуации, изискващи бърза диагностика или запазване на първоначалното състояние на тъканта.
Основно приложение 1: Бърза клинична патологична диагностика
В операционната зала времето е живот. Когато пациент с рак се подложи на операция за отстраняване на тумор, хирургът спешно трябва да знае дали раковите клетки остават на границата на резекция – което определя дали е необходимо по-широко изрязване. Интраоперативното изследване на замразен участък е „златен стандарт“ инструмент за тази цел.
Интраоперативният процес на замразени срезове е: тъканта, отстранена по време на операция, незабавно се изпраща в отделението по патология, където техник я замразява, срязва и оцветява – целият процес отнема само 15–30 минути. След това патологът изследва слайда под микроскоп, за да определи доброкачествен спрямо злокачествен статус, статус на границата и дали лимфните възли имат метастази. Според статистическите данни от отдела по патология на болницата на Peking Union Medical College всяка година се извършват повече от 5000 интраоперативни прегледа на замразени срезове, разчитащи на криостатни микротомове, с точност над 95%. При операции на щитовидната жлеза, гърдата, яйчниците и други места тази технология значително намалява вероятността от повторна операция.
Основно приложение 2: Неврологични изследвания
Тъканите на мозъка и гръбначния мозък са меки и богати на липиди; конвенционалните парафинови срезове са склонни да се напукват или свиват. Криостатният микротом перфектно решава този проблем. Изследователите могат да замразят свежа или фиксирана мозъчна тъкан и да я нарежат на дебели участъци от 20-100 микрона за невроанатомично проследяване, имунохистохимия или in situ хибридизация.
Например при изследване на болестта на Алцхаймер учените използват микротом с криостат, за да нарежат мозъка на мишка на серийни срезове и след това да оцветят с амилоид-бета антитела, за да визуализират ясно разпределението на сенилните плаки. По подобен начин, при модели на инсулт, чрез комбиниране на замразени срезове с оцветяване с TTC, обемът на церебралния инфаркт може да бъде точно измерен. Може да се каже, че без криостатния микротом ефикасността на съвременните невронаучни изследвания би била значително намалена.
Основно приложение 3: Разработване на лекарства и токсикологична оценка
Преди ново лекарство да бъде пуснато на пазара, неговата безопасност и ефикасност трябва да бъдат оценени при животни. Патологичното изследване е основен компонент на токсикологичната оценка. Тъкани като сърце, черен дроб, бъбрек и бял дроб, отстранени от плъхове, кучета или маймуни – някои от тях трябва да бъдат разделени върху криостат за оцветяване с Oil Red O, специално оцветяване, което открива мастни вакуоли в тъканите и е ключов индикатор за това дали дадено лекарство причинява мастна дегенерация. Парафиновото разделяне разтваря липидите, така че трябва да се направи с криостатен микротом.
Освен това, при фармакодинамични проучвания на противотуморни лекарства, изследователите често бързо замразяват и разделят ксенотрансплантирани тумори и използват Ki-67 или TUNEL оцветяване, за да оценят ефектите на лекарството върху туморната пролиферация и апоптоза. Замразените срезове запазват максимално антигенната активност, което прави имунофлуоресцентните сигнали по-силни и надеждни.
Основно приложение 4: Изследване на метаболитни заболявания и мастна тъкан
Затлъстяването и диабетът са глобални здравни предизвикателства. Изследването на мастната тъкан е неотделимо от криостатния микротом. Тъй като липидните капчици вътре в адипоцитите се разтварят от органични разтворители по време на конвенционалното вграждане в парафин, оставяйки празни пространства. Замразени срезове, комбинирани с оцветяване с маслено червено O или суданово черно, могат да разкрият достоверно размера и разпределението на липидните капчици.
Например, когато изучават трансформацията между бяла и кафява мастна тъкан, изследователите замразяват секции на миши епидидимални мастни възглавнички или интерскапуларна кафява мазнина, за да наблюдават мултилокуларни липидни капчици и UCP1 протеинова експресия. Този тип работа предоставя директни хистологични доказателства за разработването на лекарства за отслабване.
Основно приложение 5: Ботаника и селскостопански науки
Растителните тъкани съдържат големи количества вода и клетъчни стени и често имат лигнифицирани или суберизирани структури. Конвенционалното парафиново разделяне отнема много време и е трудно. Криостатният микротом може да изреже стъбла, листа или корени на пресни растения в рамките на минути, за да наблюдава структурата на съдовия сноп, разпределението на устицата или патогенната инфекция.
Например, при изследване на устойчивостта на болести по растенията, учените замразяват листата на пшеницата, заразени с гъбички, и след това оцветяват с флуоресцентни багрила, за да наблюдават директно пътя на разширяване на хифите между мезофилните клетки под конфокален микроскоп. Този метод елиминира дехидратацията, вграждането и други стъпки, като избягва морфологичните промени в гъбичките, причинени от химическо третиране.
Технологични граници: Бъдещата еволюция на криостатните микротоми
Съвременните криостатни микротомове вече не са "простите студени кутии" от миналото. Новите модели са оборудвани с:
Интелигентно управление със сензорен екран: може да съхранява параметри за разделяне (дебелина, температура, позиция на плочата против преобръщане) за стотици типове тъкани, извикани с едно докосване.
Моторизирана секционна система: осигурява еднаква дебелина на профилите и намалява човешката грешка.
UV дезинфекция и антимикробни повърхности: предотвратява заразяване на оператора с патогени, особено ценно за защита на биобезопасността при изследвания, включващи ХИВ, туберкулоза или нови коронавируси.
Етап на бързо замразяване (охлаждане на Пелтие): може да охлади тъканта до –40°C в рамките на 2 минути, което значително намалява времето за изчакване.
Инсайдери от индустрията прогнозират, че с нарастването напространствена транскриптомика, криостатният микротом ще играе още по-критична роля – тъй като такива технологии изискват улавяне на иРНК директно върху прясно замразени тъканни срезове, което изисква изключително висока тъканна морфология и цялост на нуклеинова киселина. Всеки процес на фиксиране или вграждане може да причини загуба на сигнал.
Заключение: „Нож с ниска температура“ отключва безброй мистерии
От решения за живот и смърт на операционната маса до детайлно картографиране в науката за мозъка; от оцветяването с Oil Red O на мастните клетки до микроскопичния свят на корените и стъблата на растенията – криостатният микротом отдавна е надхвърлил обикновения инструмент, превръщайки се в мост, свързващ морфологията на тъканите и молекулярната информация. Тя позволява на учените да надникнат в деликатната конструкция на живота в състояние, най-близко до физиологията.
Ако вашата лаборатория или изследователска институция обмисля закупуване или надграждане на оборудване за разделяне на замразени секции, струва си да разгледате по-нови модели, включващи интелигентен контрол на температурата, оптимизирани плочи срещу преобръщане и моторизирани функции за напредване. Един добър "нискотемпературен скалпел" може да бъде отправната точка за следващото ви голямо откритие.