Флуоресцентната микроскопия е мощна техника, която позволява на изследователите да визуализират специфични молекули и структури в клетките и тъканите. За да се подготвят проби за флуоресцентна микроскопия, криостатният микротом често се използва за изрязване на тънки срезове от замразена тъкан. В тази публикация в блога ще споделя някои прозрения за това как да използвам криостатен микротом за флуоресцентна микроскопия, черпейки от моя опит като доставчик на криостатен микротом.
Разбиране на криостатния микротом
Криостатният микротом е специализиран инструмент, предназначен да изрязва тънки срезове от замразена тъкан при ниски температури. Състои се от режещо острие, държач за образец и камера с контролирана температура. Ниската температура спомага за запазване на тъканната структура и предотвратява разграждането на флуоресцентните молекули.
На пазара има различни видове криостатни микротомове. Например, наКриотомпредлага прецизни възможности за рязане, докатоПолуавтоматични криостатиосигурява добър баланс между автоматизация и потребителски контрол. НашитеКриостат Микротомсъчетава разширени функции, за да отговори на разнообразните нужди на изследователите.
Подготовка на криостатния микротом
Преди да използвате криостатния микротом, важно е инструментът да се подготви правилно. Първо почистете режещото острие и държача на образеца, за да отстраните всякакви остатъци или замърсители. Използвайте подходящ почистващ разтвор и мека четка, за да осигурите цялостно почистване.
След това задайте температурата на криостатната камера. Идеалната температура зависи от вида тъкан, която се срязва. Обикновено температура между -18°C и -25°C е подходяща за повечето тъкани. Оставете криостата да достигне зададената температура, преди да продължите.
Подготовка на тъканната проба
Качеството на подготовката на тъканната проба е от решаващо значение за успешната флуоресцентна микроскопия. Започнете с фиксиране на тъканта в подходящ фиксатор. За флуоресцентна микроскопия обикновено се използват фиксатори като параформалдехид, тъй като те запазват добре флуоресцентните сигнали.
След фиксиране тъканта трябва да бъде криопротектирана. Това включва потапяне на тъканта в разтвор на криопротектор, като захароза, за да се предотврати образуването на ледени кристали по време на замразяване. След това тъканта се замразява в подходяща среда за замразяване, като OCT съединение.
Монтиране на тъканта върху държача за проби
След като тъканта е замразена, тя трябва да се монтира върху държача за проби. Внимателно поставете блока от замразена тъкан върху държача на образеца и го закрепете с помощта на подходящото устройство за монтаж. Уверете се, че кърпичката е центрирана и здраво закрепена към държача, за да осигурите точно разрязване.
Задаване на параметрите за разделяне
Преди да започнете процеса на разделяне, задайте параметрите за разделяне на криостатния микротом. Тези параметри включват дебелина на секцията, скорост на рязане и скорост на напредване. Дебелината на среза зависи от вида на тъканта и изискванията на експеримента с флуоресцентна микроскопия. За повечето приложения е подходяща дебелина на профила от 5 - 10 микрометра.
Скоростта на рязане и скоростта на напредване трябва да се регулират въз основа на твърдостта на тъканта. По-меките тъкани може да изискват по-бавна скорост на рязане и по-малка скорост на придвижване, докато по-твърдите тъкани могат да понасят по-висока скорост на рязане.
Разрязване на тъканта
След като параметрите са зададени, започнете процеса на разделяне. Бавно придвижете държача на образеца към режещото острие. Докато острието прорязва тъканта, ще се получат тънки участъци. Използвайте фина четка или повдигач за срезове, за да прехвърлите внимателно срезовете върху предметно стъкло.
Важно е да боравите внимателно със секциите, за да избегнете повреда. Уверете се, че секциите са равномерно разпределени върху слайда и не се припокриват.
Флуоресцентно оцветяване на срезовете
След разделянето следващата стъпка е да оцветите срезовете с флуоресцентни багрила. Налични са различни флуоресцентни багрила за различни приложения, като DAPI за ядрено оцветяване и бои Alexa Fluor за специфично маркиране на протеини.
Пригответе разтвора за оцветяване според инструкциите на производителя. Инкубирайте срезовете в оцветяващия разтвор за подходящото време. След оцветяване, измийте секциите старателно, за да отстраните излишната боя.
Монтиране на оцветените секции
След като срезовете са оцветени, те трябва да се монтират върху покривно стъкло. Използвайте подходяща среда за монтаж, която е съвместима с флуоресцентните багрила. Поставете капка от монтиращата среда върху оцветените участъци и внимателно спуснете покривното стъкло върху предметното стъкло, като избягвате образуването на въздушни мехурчета.
Изобразяване на секциите
Накрая оцветените срезове са готови за флуоресцентна микроскопия. Поставете предметното стъкло върху предметния стол на микроскопа и регулирайте фокуса и увеличението, за да визуализирате флуоресцентните сигнали. Използвайте подходящите филтри, за да откриете различните флуоресцентни багрила.
Отстраняване на неизправности и съвети
- Раздел Качество: Ако участъците са набръчкани или разкъсани, проверете режещото острие за тъпота или повреда. Острото острие е от съществено значение за производството на висококачествени профили.
- Флуоресцентен сигнал: Ако флуоресцентният сигнал е слаб, проверете протокола за оцветяване. Уверете се, че времето за оцветяване и концентрацията на багрилото са подходящи. Също така се уверете, че секциите не са прекалено измити, тъй като това може да намали флуоресцентния сигнал.
- Контрол на температурата: Поддържайте стабилна температура в камерата на криостата през целия процес на разделяне. Колебанията в температурата могат да повлияят на качеството на секциите.
Контакт за покупка и консултация
Ако се интересувате от закупуването на криостатен микротом за вашите нужди от флуоресцентна микроскопия или ако имате въпроси относно използването му, не се колебайте да се свържете с нас. Нашият екип от експерти е готов да ви помогне да намерите правилния инструмент за вашето изследване.
Референции
- Хистология: текст и атлас от Michael H. Ross и Wojciech Pawlina.
- Флуоресцентна микроскопия: принципи, техники и приложения от Richard P. Haugland.